DirectPCR Lysis Reagent (Cell)

細胞直接PCR裂解液 裂解+PCR一步到位

           Cat#301-C/302-C

產品關鍵詞：

Viagen Biotech; DirectPCR® 直接PCR；PCR genotyping 基因分型；Proteinase K蛋白酶K；301-C/ 302-C；

產品介紹：

Viagen DirectPCR® DNA提取系統是一種單管式快速DNA制備系統，適用于小鼠尾組織、耳組織、卵黃囊及培養(yǎng)細胞。該技術采用Viagen Biotech Inc.科學家研發(fā)的組分，確保提取的DNA可直接用于基因組PCR分型。動物組織與細胞中的某些成分會抑制PCR反應。DirectPCR裂解試劑含有特異性抑制因子，可中和此類PCR抑制物。因此，經DirectPCR試劑釋放的DNA可直接用于一步法PCR基因分型。DirectPCR試劑不僅能介導生物樣本的快速裂解，其抑制因子還可有效中和粗提液對PCR擴增的抑制活性，同時最大限度保持釋放的基因組DNA完整性。該裂解液簡易操作流程避免了溶液轉移或開管步驟，為您節(jié)省大量額外時間。

產品特點：

與傳統方法相比，DirectPCR®系統具有以下顯著優(yōu)勢：

· 省時：操作時間更短，粗提裂解液可直接用于PCR

· 經濟：性價比高

· 安全：不含有機試劑

· 環(huán)保：減少廢棄物產生（有機試劑、離心管、槍頭等）

· 穩(wěn)定高效：成功率近100%，且DNA得率高

操作流程：（細胞直接PCR裂解液）

1.   將10cm培養(yǎng)板中的細胞懸浮于200-300µl DirectPCR裂解試劑（細胞）中，試劑需含有新鮮配制的0.2-0.4mg/ml蛋白酶K（Sigma，產品編號p6556，不包含）。蛋白酶K在DirectPCR試劑中可穩(wěn)定存在約24小時。如果處理的細胞數量較少，難以稱量蛋白酶K干粉，可使用基因組PCR級蛋白酶K溶液（Viagen Cat#501-PK），濃度為0.5-1.0 mg/ml（每1 ml DirectPCR試劑加入25-50µl蛋白酶K溶液）。

注意：對于少量細胞，可將DirectPCR試劑用蒸餾水稀釋至多10倍，然后按比例增加裂解液體積用于PCR（見表1）。

2.   將試管置于55℃的旋轉雜交爐中旋轉5-6小時，直至無團塊可見。如有需要，可旋轉過夜，效果不會降低。充分裂解非常重要。為獲得可重復的結果，建議在2-3小時后搖動裝有試管的瓶子，重新調整試管位置。

注意：旋轉雜交爐的效果優(yōu)于搖板。對于少于150 µl DirectPCR試劑（細胞）的情況，使用0.75 cm試管。長時間旋轉導致的DNA斷裂不會顯著影響PCR效果。對于不同大小的樣本，按比例使用DirectPCR裂解試劑。

3.   將粗裂解液在85°C水浴中孵育45分鐘，將整個試管架漂浮于水浴上。（可選）在步驟4之前，離心10秒以沉淀雜質。粗裂解液可在-20℃保存1年（或在4℃保存1周），效果不會降低。

4.   每50 µl PCR反應使用0.5-1µl裂解液。推薦使用Eppendorf Hotmaster Taq聚合酶（cat#954-14-5018）、Sigma JumpStart Taq DNA聚合酶（產品編號D9307）或Qiagen HotStar Taq DNA聚合酶（產品編號203203）進行PCR。

DNA回收：粗裂解液中的DNA可回收用于進一步分析。加入NaCl至終濃度為250 mM，然后加入0.7體積的異丙醇。DNA將形成沉淀。4℃離心2分鐘，棄上清，用1 ml 70%乙醇洗滌DNA，溶解于50µl 10mM Tris-HCl（8.0）中。取1µl用于PCR。

表1. 培養(yǎng)的哺乳動物細胞建議起始裂解條件

^*使用旋轉雜交爐裂解。** 使用搖板裂解。用磷酸鹽緩沖液洗滌96孔板中的細胞兩次，加入60µl 2倍稀釋的DirectPCR試劑（細胞）。55℃孵育過夜。將96孔板置于濕盒中，漂浮于85℃水浴上1.5小時。多次吸打混勻。取1ul裂解液用于PCR。

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